O melhoramento molecular avançado em culturas de bioenergia depende da capacidade de amostrar massivamente a diversidade genética. A genotipagem por sequenciamento tornou-se um método amplamente adotado para genotipagem econômica. Basicamente, não requer investimento inicial para design em comparação com plataformas baseadas em array, que demonstraram oferecer ensaios muito robustos. Este último, no entanto, apresenta a desvantagem de estar vinculado à diversidade genética contabilizada durante a seleção e o design. Davide Scaglione e colegas apresentam uma nova forma de combinar as vantagens de ambas as tecnologias.
Scaglione disse: “Os arrays olham atentamente apenas para as mutações do catálogo, nunca para as novas. Em vez disso, a genotipagem por sequenciamento sempre explora novas mutações à medida que pequenos pedaços de DNA são lidos. Juntamente com o estado do site “catálogo”, exploramos bases extras do DNA e se um novo alelo estiver lá, ele é detectado e potencialmente usado para encontrar associação de fenótipos. Uma associação pode não ser encontrada apenas com alelos de catálogo, pois o fenótipo pode ser herdado por alelos não determinados anteriormente”.
Um problema é que, embora a genotipagem por sequenciamento com amostragem aleatória de loci genômicos por meio de enzimas de restrição ou priming aleatório tenha se mostrado rápida e conveniente, ela não tem a capacidade de atingir regiões específicas do genoma e manter alta reprodutibilidade em laboratórios.
Scaglione e seus colegas apresentam uma primeira adoção da tecnologia de enriquecimento de primer único (SPET), que fornece um sistema altamente eficiente e escalável para obter grandes conjuntos de dados de genotipagem baseados em sequência direcionados, preenchendo as lacunas entre o sistema baseado em matriz e os protocolos tradicionais baseados em sequenciamento. Para explorar totalmente o desempenho do SPET, eles conduziram um estudo de referência em dez Zea mays linhas e um estudo em grande escala de uma população natural de choupo preto de 540 indivíduos com o objetivo de descobrir polimorfismos associados a características relacionadas à biomassa.
Seus resultados mostraram a capacidade dessa tecnologia em fornecer informações genotípicas densas em um painel personalizado de polimorfismos selecionados, ao mesmo tempo em que produz centenas de milhares de sites variáveis não direcionados. Isso forneceu um recurso ideal para análise de associação de populações naturais que abrigam diversidades e estruturas alélicas inexploradas, como no choupo preto.
A melhoria do rendimento do sequenciamento e o desenvolvimento de métodos eficientes de preparação de bibliotecas tornaram viável a realização de experimentos direcionados de genotipagem por sequenciamento com custos competitivos com sistemas de redução de complexidade aleatória ou plataformas tradicionais baseadas em matriz, mantendo as principais vantagens de ambos tecnologias.
“Essa pesquisa aumentará a utilização do sequenciamento direcionado como um método de escolha para melhoramento molecular e seleção genômica em espécies de cultivo, especialmente para aquelas com recursos limitados”, disse Scaglione.
