As tecnologias de edição do genoma tornaram-se ferramentas valiosas em muitos aspectos da pesquisa científica, facilitando, por exemplo, a identificação de genes envolvidos no desenvolvimento ou a determinação de funções de proteínas. Eles trabalham criando quebras no genoma, que são então reparadas juntando as extremidades do DNA. Frequentemente ocorrem erros durante este processo, levando potencialmente a mutações de perda de função. Além disso, como ambas as fitas do DNA são quebradas, oferece uma oportunidade de incorporar novas sequências de DNA ao genoma.
O sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas (CRISPR-associated) é um desses métodos de edição do genoma. Tornou-se difícil de ignorar, tendo recebido grande atenção tanto da comunidade científica quanto da mídia. Uma história que recebeu cobertura significativa foi a aprovação de um laboratório, com sede em Londres, para use a edição do genoma CRISPR em embriões humanos. Vários artigos também demonstraram o grande número de aplicações potenciais para esta técnica em animais, por exemplo, produzindo gado que não desenvolve chifres e, portanto, evita a necessidade de procedimentos dolorosos para removê-los. A razão de tanto entusiasmo em relação ao CRISPR é, em parte, devido à sua simplicidade e eficácia.
O sistema CRISPR tipo II requer apenas um crisprRNA (crRNA), um crRNA transativador (tracrRNA) e uma proteína Cas9. As sequências de RNA podem ser fundidas para criar um único guideRNA (gRNA). Isso pode ser reprogramado alterando uma região de 20 pb conhecida como sequência espaçadora, para direcionar a proteína Cas para quase qualquer região do genoma, conhecida como protoespaçador. A proteína Cas9 reconhece uma sequência de reconhecimento de 3 pb dentro do genoma, conhecida como motivo protoespaçador adjacente (PAM). Isso permite que ele se ligue e introduza uma quebra na sequência de DNA, exatamente 3 pb a montante do PAM (Belhaj et al., 2013). Ao contrário de técnicas alternativas para a introdução de quebras de DNA, como TALENs, várias regiões genômicas podem ser facilmente direcionadas simplesmente modificando as sequências de RNA usadas para direcionar a proteína Cas.
Um estudo recente da Gao et al. (2016) tentou projetar uma maneira de identificar com eficácia mutações hereditárias criadas usando CRISPR/Cas9 na geração T2 de Arabidopsis. Atualmente, as técnicas utilizadas são demoradas e trabalhosas. Ao incluir uma proteína fluorescente dentro do plasmídeo CRISPR, sob uma CRISPR / Cas9 promotor do vetor, os autores conseguiram rastrear facilmente as sementes da planta mutante que ainda expressavam a proteína Cas9 usando técnicas simples de microscopia. Isso é importante ao tentar determinar se uma mutação é hereditária, pois uma planta T2 que ainda expressa o construto CRISPR provavelmente terá uma mutação devido à atividade contínua de Cas9, em vez de tê-la herdado da planta-mãe.
Uma desvantagem significativa do sistema CRISPR são os altos níveis de mutações fora do alvo que podem ser introduzidas como resultado. Isso torna importante determinar com precisão se o Cas9 gene foi segregado, pois as plantas que continuam a expressar a proteína Cas9 são muito mais propensas a desenvolver essas modificações indesejáveis em outras partes do genoma. Além disso, a expressão contínua pode levar a mutações somáticas falsamente identificadas como hereditárias, o que aumenta muito o tempo necessário para rastrear plantas contendo mutações derivadas de CRISPR/Cas9 em gerações subsequentes.
Vários estudos relataram o uso bem-sucedido de CRISPR/Cas9 em plantas (Bortesi e Fischer, 2015), mas pouca ênfase foi colocada em garantir que a proteína Cas9 tivesse sido segregada. Estudos futuros, particularmente aqueles que requerem mutações hereditárias, devem colocar mais foco nas plantas que contêm a mutação sem expressão contínua do construto CRISPR/Cas9. Isso reduzirá significativamente o tempo de triagem para plantas contendo as mutações derivadas de CRISPR/Cas9, bem como reduzirá a probabilidade de mutações fora do alvo em outras partes do genoma. Atualmente, este trabalho foi feito usando o organismo modelo popular Arabidopsis, mas será interessante ver se tais técnicas podem ser expandidas para uso em outros sistemas de plantas.
