O que acontece por trás dessas paredes? Esta questão fundamental tem fascinado gerações de botânicos desde a primeira observação microscópica de células vegetais em 1665, e certamente irá entreter muitos mais nos séculos vindouros. Aprendemos muito sobre o funcionamento interno das plantas desde então. No entanto, muitas destas descobertas não foram feitas através de imagens diretas, mas sim de medições indiretas seguidas de dedução razoável. As representações coloridas de processos intracelulares encontradas nos livros didáticos são, em grande parte, aproximações do que pode ser concluído após a extração do conteúdo celular, agitando-o em tubos de ensaio com alguns produtos químicos, executando esse coquetel em máquinas caras e observando os números desses instrumentos. cuspir por tempo suficiente. Não são imagens reais do que é, mas imaginações ponderadas do que poderia ser. Por muito tempo, o mais próximo que os cientistas conseguiram chegar de uma representação realista foram as imagens citológicas tiradas de preparações histológicas de tecido morto após fixação e coloração. Estes foram instantâneos momentâneos congelados no tempo e no espaço e não revelaram nada sobre processos dinâmicos, deixando os investigadores no escuro sobre as atividades internas que definem a vida.

No entanto, uma forma de tornar visível o invisível já havia sido descoberta em meados do século XIX.^thséculo pelo físico George Gabriel Stokes em uma solução de quinino. O líquido transparente e incolor iluminou-se em um azul celeste quando colocado na borda de um espectro de luz solar dispersa por um prisma. Maravilhado com o que testemunhou, Stokes escreveu: “Foi certamente uma visão curiosa ver o tubo acender instantaneamente quando mergulhado nos raios invisíveis: era literalmente escuridão visível. Ao todo, o fenômeno tinha uma aparência algo sobrenatural.” É com este fenómeno que hoje em dia se maravilham os frequentadores de discotecas ao saborearem o seu gin tónico junto a uma luz negra, a mesma que elevou um biólogo marinho japonês ao reino dos galardoados com o Prémio Nobel e que detém o poder de lançar luz sobre a dinâmica intracelular. e revolucionou a biologia molecular.

Stokes cunhou a emissão de luz que observou como “fluorescência”, e ocorre quando certos átomos ou moléculas são excitados pela luz de um comprimento de onda específico e emitem luz de comprimento de onda mais longo após um tempo muito curto. Cerca de um século depois de Stokes, Osama Shimomura coletou quase 10,000 exemplares de água-viva Vitória Aequorea nas águas do Pacífico para resolver o mistério do brilho sedutor do animal e extraiu com sucesso uma proteína fluorescente verde (GFP). Levaria mais cerca de 30 anos até que a GFP fosse sequenciada e clonada, o que permitiu a sua expressão noutros organismos e tornou-a hoje numa ferramenta indispensável para a investigação não invasiva. in vivo análise de atividades fisiológicas em nível subcelular ou de organismo.

A mutagênese dirigida ao local da GFP original produziu uma vasta gama de moléculas produtoras de fluorescência, chamadas fluoróforos, com diferentes propriedades fotofísicas. Diferentes proteínas podem assim ser visualizadas simultaneamente usando tags fluorescentes separadas espectralmente. Não só a sua localização, mas também qualquer interação potencial entre proteínas de interesse é detectável desta forma. Para que as proteínas interajam, elas devem estar muito próximas de apenas alguns nanômetros. Quando a distância entre os fluoróforos ligados torna-se suficientemente pequena, a energia de um feixe de laser absorvido por um pode ser transferida para o outro, o que diminui o tempo de vida da fluorescência e o rendimento de emissão de luz do fluoróforo doador e aumenta a fluorescência do aceitador. Esta chamada transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) é registrada e analisada em microscopia de imagem de fluorescência vitalícia (FLIM) – uma técnica que permite aos pesquisadores medir quanto tempo um fluoróforo permanece no estado excitado antes de produzir luz.

No entanto, o uso da análise de fluorescência em plantas é notoriamente desafiador devido à alta autofluorescência interna de compostos como a clorofila ou a lignina da parede celular. Os sinais de proteínas pouco abundantes marcadas com fluorescência são, portanto, muitas vezes abafados pela “poluição luminosa” interna. Soluções alternativas para aumentar a relação sinal-ruído, como expressar proteínas sob promotores mais fortes, podem facilmente levar a artefatos e má interpretação de dados.

Para superar essas limitações, a Dra. Elena Kristin Petutschnig e colegas estabeleceu um novo par de fluoróforos Com propriedades superiores, que apresentaram recentemente no Journal of Experimental Botany, os fluoróforos doador e aceptor fluorescentes mCitrine e mScarlet-I (nomeados em referência às suas respectivas emissões de luz amarela e vermelha) apresentam sobreposição nos espectros de absorção e emissão de luz, um pré-requisito para o estudo da interação de proteínas usando FRET/FLIM. Eles exibem excelente brilho e, portanto, são ideais para proteínas com baixos níveis de expressão. Os autores validaram a funcionalidade dos fluoróforos usando duas partes de um complexo receptor celular que detecta um composto fúngico e desencadeia uma resposta de defesa da planta, e revelaram detalhes até então desconhecidos sobre a interação dos componentes. O par de fluoróforos demonstrou, assim, lançar nova luz sobre processos intracelulares, e o trabalho possui grande potencial para elucidar ainda mais o que ocorre por trás das paredes celulares das plantas.

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Petutschnig EK, Pierdzig L, Mittendorf J, Niebisch JM, Lipka V. 2024. Um novo par de proteínas fluorescentes facilita a análise FLIM-FRET da interação do receptor imune de plantas sob condições nativas. Revista de Botânica Experimental 75, 746-759. https://doi.org/10.1093/jxb/erad418

Mareike Jezek

Dr. Jezek é editor assistente do Journal of Experimental Botany, um dos periódicos oficiais do Sociedade de Biologia Experimental.